La noche ha caído sobre el Smithsonian de Washington. Los guías se han ido a casa, las luces están apagadas, los escolares están en la cama bien arropados... pero algo increíble empieza a agitarse cuando el antiguo vigilante nocturno Larry Daley (Ben Stiller) se ve atraído a la mayor aventura de cuantas ha vivido, la que dejaría más atónito a cualquiera, en la que la historia cobra realmente vida. En esta segunda entrega de la saga de Noche en el Museo, Larry libra un combate de tan épicas proporciones que sólo podría desarrollarse en los pasillos del museo más grande del mundo. Ahora, Larry debe tratar de salvar a sus antes inanimados amigos de lo que podría ser su última estancia entre las maravillas del Smithsonian, todas las cuales, desde los famosos cuadros que adornan las paredes a las naves cohete de las salas, adquieren de repente ideas propias.

En esta película, la primera rodada en el complejo Smithsonian, la diversión comienza cuando Larry ha salido del mal remunerado mundo de la vigilancia de museos para transformarse en el solicitado inventor de productos para publirreportajes de la marca Daley Devices. Parece tenerlo todo –pero a su vida le falta algo, algo que vuelve a arrastrarle al lugar que antaño solía frecuentar, el Museo de Historia Natural, donde en una ocasión pasó la noche mágica de su vida. Una vez allí, hace un descubrimiento inquietante. Sus piezas favoritas, que, en efecto, se convirtieron en unos de sus amigos más fieles, han sido consideradas obsoletas. Embaladas en cajas, aguardan el momento de su envío a los inmensos almacenes del Smithsonian.

Su destino es una incógnita –es decir, hasta que Larry recibe una llamada de socorro del diminuto vaquero Jedediah (Owen Wilson), quien le informa de un desastre inminente. Parece que los recién llegados han despertado a los moradores de su nuevo domicilio, entre los que se cuenta el soberano egipcio, Kahmunrah (Hank Azaria), que demuestra un humor especialmente desagradable después de haberse echado un sueño de tres milenios. Ahora, él, unido a un trío formado por los sicarios más abyectos de la historia -a saber, Iván el Terrible (Christopher Guest), Napoleón Bonaparte (Alain Chabat) y Al Capone (Jon Bernthal)- está tramando apoderarse del museo (y después del mundo), dando rienda suelta a un auténtico Ejército del Mundo de los Muertos.

Trasladándose a toda prisa a la capital de la nación, Larry se ve claramente superado. Pero cuenta con algunos nuevos e impresionantes amigos –desde el brillante Albert Einstein al honrado Abraham Lincoln, pasando por una pieza que le deja sin aliento –la indomable Amelia Earhart (Amy Adams), que espolea a Larry para que descubra el sentido de la diversión y la aventura que había perdido. Aliado con sus antiguos compinches, entre los que se cuentan Teddy Roosevelt (Robin Williams), Octavio (Steve Coogan), Sacajawea (Mizuo Peck), Atila el Rey de los Hunos (Patrick Gallagher) y los Hombres de Neandertal -Larry no se detendrá ante nada para recuperar a sus amigos y restablecer el orden en el Bulevar Nacional, desde el Memorial de Lincoln hasta el Museo del Aire y del Espacio, antes del amanecer.