Alessandra Mastronardi debutó muy joven como actriz. En 2006, I Cesaroni, una de las series de televisión italianas más famosas de los últimos 15 años, le dio éxito y gran popularidad.

En 2008, fue uno de los principales personajes femeninos de Romanzo Criminale dirigida por Stefano Sollima, un papel totalmente diferente para ella. Después de muchas series de cine y televisión en coproducciones estadounidenses, como Pío XII, bajo el cielo de Roma dirigida por Christian Duguay, con James Cromwell, 2011 fue un año importante que dió un giro a su carrera, comenzando con otro gran proyecto televisivo, la coproducción inglesa Titanic: Sangre y Acero dirigida por el director irlandés Ciaran Donnelly.

El mismo año, Woody Allen la eligió para su película A Roma con amor. Esta película le abrió las puertas a su carrera internacional. En 2012, fue Julieta en la película para televisión Romeo & Julieta dirigida por Enrico Oldoini, otra coproducción inglesa.

El mismo año, la película L'ultima Ruota del Carro dirigida por Giovanni Veronesi, que protagonizó con Elio Germano, y abrió el Festival de Cine de Roma.

En 2014 interpretó el papel femenino principal en la película Life dirigida por Anton Corbijn, con Robert Pattinson y Dane Dehaan. La película fue presentada en el Festival Internacional de Cine de Berlín 2015. En noviembre de 2014, regresó a la pantalla grande con la comedia Ogni Maledetto Natale, dirigida por Giacomo Ciarrapico, Mattia Torre y Luca Vendruscolo.

En 2017, tuvo un papel en la película Perdido en Florencia e interpretó un papel principal en la segunda temporada de la galardonada serie de Netflix Master of None. La serie ha ganado tres premios Emmy(r) y un Globo de(r) Oro, y fue nominada en los Critics Choice Awards como Mejor Actriz de Reparto en una Serie de Comedia.

El mismo año, también estuvo en la segunda temporada de la serie de Netflix Los Medici y protagonizó la serie de televisión italiana L'allieva; que duró tres temporadas. En 2018, comenzó a filmar la tercera temporada de Los Medici.

En 2020, interpretó a la estrella mundialmente conocida Carla Fracci en la película biográfica Carla dirigida por Emanuele Imbucci. En el último año ha rodado tres películas italianas, que saldrán en 2022.