Comenzó su carrera en el teatro, protagonizando en papeles clásicos como Julieta en "Romeo and Juliet", Cordelia en "King Lear", Irina en "The Three Sisters", y Emily en "Our Town", entre muchas otras. Hizo su debut en Broadway junto a Julie Harris en "The Glass Menagerie", por la que recibió el Theatre World Award, y el premio Clarence Derwent por Mejor Nuevo Talento. Entre sus créditos adicionales en el teatro de New York se encuentran "The Loop", "Sophistry", "Sons and Fathers", "Wrong Turn at Lungfish", "All for One" y "Mad Forest".

En 1997, después de numerosos créditos cinematográficos incluyendo papeles en "Naked in New York", "Quiz Show", "Pictures of Baby Jane", "The Birdcage" y "Milk & Money", Flockhart fue seleccionada como la abogada Ally McBeal en la exitosa serie de televisión del mismo nombre, escrita y creada por David E. Kelley. Por su actuación en este programa ganó el premio Golden Globe y People's Choice, y recibió varias nominaciones al Emmy.

Flockhart ha sido recientemente nombrada portavoz del programa juvenil V-Day que ayuda a ponerle fin a la violencia en contra de las mujeres en todo el mundo. También participó en una presentación de dos semanas en New York de "The Vagina Monologues" de Eve Ensler, en donde los fondos recaudados fueron destinados a la causa.