Nacida en Roma, Giovanna Mezzogiorno es hija de los actores Vittorio Mezzogiorno y Cecilia Sacchi. Su primer trabajo fue en París, donde estuvo durante dos años en el Peter Brook Workshop (Le Centre International de Crèations Thèatrales). Debutó sobre los escenarios en Bouffes Du Nord en el papel de Ofelia en Qui est lá, creada y dirigida por Peter Brook, y basada en Hamlet, de Shakespeare, con textos de Artaud, Brecht, Craig, Mayerhold, Sanislavski y Zeami, por la qu recibió el premio Coppola-Prati en 1996 (el jurado estaba presidido por el crítico teatral Franco Quadri).

En 1997, realiza su debut cinematográfico en Il viaggio della sposa, escrita y protagonizada por Sergio Rubini. Giovanna recibió el premio Nastro d'Argento al nuevo talento cinematográfico italiano. También fue galardonada con el Grolle d'Oro, el Globo de Oro y el premio Flaiano a la mejor actriz en la temporada 1997-1998.

En 1998 protagonizó la película Del Perduto Amore dirigida por Michele Placido, con Fabrizio Bentivoglio y Sergio Rubini. Recibió el galardón Nastro d'Argento, el Ciak d'Oro y el Premio Pasinetti a la mejor actriz protagonista. También en 1998, Giovanna interpretó el papel de una joven con distrofia muscular para la televisión Italian National Television Network, RaiDue.

En 1999, interpretó el papel de Silvia en la película Un uomo perbene, con Michele Palcido y Mariangela Melato, dirigida por Maurizio Zaccaro. También en 1999, protagonizó la película Asini, dirigida por Antonello Grimaldi, con Claudio Bisio.

En 2000, estuvo viajando entre Praga y Paris para trabajar para la película televisiva Los Miserables, dirigida por Josèe Dayan, con Gèrard Depardieu, y John Malkovich. Posteriormente trabajó en Dinamarca en Nobel, dirigida por Fabio Carpi, con Hector Alterio. En Italia ha trabajado con Puglielli en Tutta La Conoscenza Del Mondo y después en El último beso, dirigida por Gabriele Muccino con Stefano Accorsi y Stefani Sandrelli (ganando el Premio Flaiano).

En 2001, interpretó el personaje de Francesca en la película Malefemmene con Angela Molina, del director Fabio Conversi. Ella también ha trabajado en State Zitti Per Favore, con Adriano Giannini y dirigida por Livia Giampalmo, interpretando a una madre de gemelos.

En 2002, interpretó a la periodista asesinada Ilaria Alpi en la película Il Piu Crudele Dei Giorni. Posteriormente se trasladó a Francia para rodar la serie Daddy, dirigida por Giacomo Battiato y protagonizada por Klaus Maria Brandauer. De vuelta en Italia, protagonizó la película La ventana de enfrente, dirigida por Ferzan Ozpetek, interpretación que le valió muchos premios, incluyendo el David di Donatello (el Oscar italiano), el Ciak d'Oro, el Nastro d'Argento, el Globo de Oro de la prensa extranjera (Globo de Oro Europeo), el premio Flaiano Award, y el premio Karlovy Vary.

En 2003, participó en L'amore ritorna, dirigida por Sergio Runini, y en la película francesa Au secours, j'ai 30 ans, de la directora Marie-anne Chazel, con Pierre Palmade.

En 2004, Giovanna protagonizó Virginia, dirigida por Alberto Sironi antes de retornar al teatro para trabajar con el director Piero Maccarinelli en 4.48 Psicosi, de Sarak Kane, una interpretación muy acalmada.

Giovanna protagonizó La Bestia Nel Cuore, dirigida por Cristina Comencini, interpretacion con la que consiguió la Coppa Volpi a la mejor actriz en la 62 edición del Festiva de Cine de Venecia.