A los 18 años, Guillaume Gallienne decidió estudiar historia y teatro al mismo tiempo. Estudió cuatro años en el Cours Florent y se incorporó al Conservatoire national supérieur d'art dramatique (Conservatorio de Arte Dramático de París) donde tuvo como profesores a Daniel Mesguich, Dominique Valadié y Stéphane Braunschweig. Cuando era becario en el Théâtre du Vieux-Colombier en 1996, Daniel Mesguich le confió el papel de Arcas en Mitridates, la tragedia de Racine. Claude Mathieu encarnaba a la Reina Monime en la misma obra y eso le animó a incorporarse a la Maison de Molière. Guillaume Gallienne sustituyó a un actor que se había lesionado mientras trabajaba como suplente en la película La tempestad de Shakespeare, dirigida por Daniel Mesguich en la Comédie-Française. Esa misma noche de julio de 1998, fue elegido 'pensionario' para interpretar a Brecht en Madre coraje y sus hijos bajo la dirección de Jorge Lavelli. En 2005, se convirtió en el 'sociétaire' número 513 de la Comédie-Française. Como miembro de la compañía, ha actuado en una serie de obras entre las que cabe destacar las siguientes: Les Femmes savantes (Las mujeres sabias) de Molière dirigida por Simon Eine; Un fil à la patte de Feydeau bajo la dirección de Jérôme Deschamps (por el que ganó el premio Molière al mejor actor de reparto); Tres hermanas de Chéjov y La Trilogie de la villégiature de Goldoni con puesta en escena de Alain Françon; Oblomov de Gontcharov dirigida por Volodia Serre, que posteriormente adaptó para Arte Television en 2017; Fantasio de Musset dirigida por Denis Podalydès que posteriormente confió a Gallienne el papel principal en Lucrezia Borgia, el drama de Victor Hugo; y La caída de los dioses de Visconti con puesta en escena de Ivo van Hove.

Como parte de sus actividades fuera de la compañía de teatro, puso en escena la obra de Sartre A puerta cerrada (Huis-Clos) en el Teatro Tessenkai Noh de Tokio. Además, colaboró en la sinopsis y escribió la dramaturgia de Calígula, un ballet de Nicolas Le Riche en la Opéra national de Paris, así como la dramaturgia de Las ilusiones perdidas de Alexeï Ratmansky en el Bolshoi. En 2017 dirigió La Cenerentola de Rossini en la Opéra national de Paris que fue su primera obra lírica. Entre 2008 y 2010, su serie de sketches de comedia parodiando a la industria del cine y titulada Les Bonus de Guillaume tuvo un enorme éxito en la pequeña pantalla. Desde septiembre de 2009 presenta Ça peut pas faire de mal, un programa semanal en France Inter Radio donde lee grandes textos literarios. En 2018-2019, enseñó teatro durante un semestre en la Universidad de Princeton como miembro del Consejo de Humanidades Belknap y como profesor invitado en francés e italiano.

De niño, Guillaume Gallienne sabía imitar a su madre a la perfección. Desarrollaría esa primera gran actuación en todo su potencial en una obra autobiográfica titulada Les garçons et Guillaume, à table!, dirigida por Claude Mathieu en 2008 (que le valió el Premio Molière al mejor actor debutante masculino en 2010). Ese éxito de crítica y público se consolidó en 2013, cuando la versión cinematográfica tuvo tres millones de espectadores y ganó cinco premios César, entre ellos el de Mejor Actor y Mejor Película. También ha actuado en varios largometrajes, como en la película de Fabien Oteniente.Jet set; Maria Antonieta de Sofia Coppola; Patio de butacas de Danièle Thompson y Cézanne y yo; Le Candidat de Niels Arestrup, Sagan de Diane Kurys; Ensemble, nous allons vivre une très grande histoire d'amour de Pascal Thomas; Yves Saint Laurent de Jalil Lespert; y Perdidamente enamorado de Pierre Godeau. Maryline, la segunda película escrita y dirigida por Guillaume Gallienne se estrenó en los cines en noviembre de 2017. LA CRÓNICA FRANCESA (DEL LIBERTY, KANSAS EVENING SUN) de Wes Anderson se estrena en lulio de 2021 en los cines.

Es Caballero de la Orden Nacional del Mérito y Oficial de la Orden de las Artes y las Letras francesas.