Se crió en París y Roma. A la edad de 19 años, se trasladó a Nueva York, donde trabajó como traductora y, más tarde, como periodista para la RAI, la televisión italiana. Su vertiente popular le llevó a aparecer como corresponsal de Nueva York para el show cómico semanal italiano Laltra Domenica, con Roberto Benigni.
Su carrera como modelo comenzó cuando la fotografió Bruce Weber para el Vogue británico, y Bill King para el Vogue norteamericano. Desde entonces, la actriz trabajó con los más distinguidos fotógrafos de la industria, contándose entre ellos Richard Avedon, Steven Meisel, Helmut Newton, Peter Lindbergh, Norman Parkinson y Eve Arnold. Ha aparecido en la portada de revistas de tanto prestigio como Vogue, Elle, Marie Claire, Bazaar y Vanity Fair. En marzo de 1998, se organizó una exposición con sus fotografías, "Rossellini, Portrait of a Woman," que tuvo lugar en el Museo de Arte Moderno de París.
Rossellini debutó en el cine en 1979 en el film de Paolo y Vittorio Taviani, El prado (Il Prato, 1979). Su debut cinematográfico norteamericano fue con el film Noches de sol (White Knights, 1985), de Taylor Hackford, junto a Mikhail Baryshnikov y Gregory Hines. En 1986, fue protagonista junto a Dennis Hopper, dando vida a Dorothy Vallens, una cantante de salón atormentada, en la controvertida e inolvidable Terciopelo azul (Blue Velvet, 1986), de David Lynch. Recientemente, ha sido protagonista en La fiesta del chivo (2005), la adaptación para la pantalla grande de Luis Llosa de la novela de Mario Vargas Llosa, proyectada en el Festival de cine de Berlín de 2006; y también en All Fall Down (2006), un drama urbano de HDNet Films, compartiendo protagonismo con Anthony LaPaglia.
En 2003, Rossellini protagonizó The Saddest Music In The World (2003), de Guy Maddin, un cuento excéntrico acerca de un corcuso en plena época de la Depresión consistente en la búsqueda de la música más triste del mundo. La actriz también actuó en Roger Dodger (2002), el film de Dylan Kidd que la crítica admiró, donde también actúa Campbell Scott. En Empire (Empire, 2002), compartió protagonismo con John Leguizamo y Peter Sarsgaard.
Otros títulos cinematográficos en el haber de la actriz son Un toque de infidelidad (Cousins, 1989); Zelly and Me (1988); Corazón salvaje (Wild at Heart, 1990); La muerte os sienta tan bien (Death becomes Her, 1992); Sin miedo a la vida (Fearless, 1993); Wyatt Earp (Wyatt Earp, 1994); Big Night (Big Night, 1996); The Impostors (1998); y El funeral (The Funeral, 1996). Su encarnación de la madre judía hasídica en Corazones enfrentados (Left Luggage, 1998), dirigida por Jeroen Krabbe, fue objeto de un premio especial en el Festival de cine de Berlín de 1998.
Muy recientemente, Rossellini hizo aparición en la televisión en varios episodiso de Alias (2004-2005), de la ABC. También protagonizó el telefilm Monte Walsh (2003), para TNT, con Tom Selleck; y Napoleón (Napoleon, 2002), para A&E, con Gerard Depardieu, John Malkovich, y Sophia Loren. Otros trabajos para la televisión comprenden La leyenda de terramar (Legend of Earthsea, 2004); Merlín (Merlin, 1998); Don Quijote (Don Quixote, 2000); La Odisea (The Odissey, 1997); The Frightening Frammis (1993); The Gift (1994); Crime of the Century (1996) (Nominación al Globo de Oro); y la serie Chicago Hope (Chicago Hope, 1994-2000) (Nominación al Emmy).
Para la escena, la actriz debutó en EE.UU. en la primavera de 2004 con la pieza The Stendhal Syndrome, de Terrence McNally, en el off-Broadway.
En 1997, la George Eastman House (USA) honró a Isabella Rossellini por su trabajo en pos de la conservación de las películas de sus padres, Ingrid Bergman y Roberto Rossellini.