John Turturro estudió en la Escuela de arte dramático de Yale, y para su debut en la escena creó el papel protagonista de la pieza de John Patrick Shanley, DANNY AND THE DEEP BLUE SEA, por el que fue merecedor de un Premio Owie y de un Theater World. Desde entonces, ha actuado en piezas como ITALIAN AMERICAN RECONCILIATION; LA PUTA VIDA; THE BALD SOPRANA; WAITING FOR GODOT; encarnando el papel protagonista en THE RESISTIBLE RISE OF ARTURO UI, de Brecht; Life Z 3, de Yasmina Reza; y en SOULS OF NAPLES, de Eduardo De Filippo, por cuya labor resultó nominado a un premio Drama Desk. Muy recientemente, ha dirigido A SPANISH PLAY, de Reza, en el CSC.
En su trabajo para televisión, Turturro resultó nominado para un premio SAG por encarnar a Howard Cosell en Monday Night Mayhem (2002), y se hizo con un premio Emmy por su aparición en la serie Monk. También ha intervenido en la miniserie The Bronx is Burning (2007), donde encarna al entrenador de los Yankees, Billy Martin.
Turturro ha interpretado más de sesenta películas, entre ellas, El color del dinero (The Color of Money, 1986), de Martin Scorcese; Cinco esquinas (Five Corners, 1987), de Tony Bill; Haz lo que debas (Do the Right Thing, 1989), Cuanto más, mejor (Mo Better Blues, 1990), y Fiebre salvaje (Jungle Fever, 1991), las tres cintas dirigidas por Spike Lee; Quiz Show: El dilema (Quiz Show, 1994); Sin miedo a la vida (Fearless, 1993); Box of Moonlight: caja de luz de luna (Box of Moonlight, 1996); La tregua (La tregua, 1997), de Francesco Rosi; De éxito en éxito (Grace of My Heart, 1996), de Allison Anders; Abajo el telón (Cradle Will Rock, 1999), de Tim Robbins; El buen pastor (The Good Shepherd, 2006), de Robert DeNiro; y Muerte entre las flores (Millers Crossing, 1990), El gran Lebowski (The Big Lebowski, 1998), y O Brother! (O Brother, Where Art Thou? 2000), los tres títulos de Joel y Ethan Coen. Por su papel protagonista en otro film de los hermanos Coen, Barton Fink (Barton Fink, 1991), logró la Palma de plata al mejor actor en el Festival de cine de Cannes, además del David D. Donatello. Otras cintas suyas son La defensa Luzhin (The Luzhin Defense, 2000); Mr. Deeds (Mr. Deeds, 2002), y Escápate como puedas (Brain Donors, 1992).
Su debut como realizador cinematográfico, Mac (Mac, 1992), le valió la Camera D'Or del Festival de cine de Cannes. Asimismo, es el director de Illuminata (Illuminata, 1998), y de Romance and Cigarettes (2005).
En 2007, Turturro intervino en Transformers (Transformers, 2007), de Michael Bay; Slipstream (2007), de Anthony Hopkins; y Margot y la boda (Margot at the Wedding, 2007), de Noah Baumbach.
El actor se graduó en la Escuela de Arte dramático de Yale y en la SUNY (Universidad del Estado de Nueva York) de New Paltz.