Juliane Köhler estudió interpretación en New York y, después de su primer contrato teatral para el teatro estatal Niedersachsen de Hannover, pasó al Residenztheater de Munich, donde se convirtió en una reconocida estrella con papeles en producciones como Hedda Gabler de Ibsen, La chica de seda artificial, de Keun, y La señorita Elsa, de Schnitzler. En 1995 fue nombrada mejor actriz joven por el Ministerio de Cultura de Baviera. Desde 1999 asumió los papeles protagonistas de Stella y La dama de las camelias en el Kammerspiele de Munich y el Schauspielhaus de Frankfurt.

Köhler se estrenó en el cine en 1993 con Schattenboxer, largometraje dirigido por Lars Becker. La polifacética actriz se ganó un lugar destacado en el cine en 1999 con la historia de amor dirigida por Max Färberböck Aimée y Jaguar, por la que fue galardonada con el Oso de Plata a la Mejor Actriz en el Festival de Cine de Berlín, así como con el Premio del Cine Alemán y el Premio Cinematográfico de Baviera.

En 1999 protagonizó el gran éxito Pünktchen und Anton, de Caroline Link, con la que volvió a colaborar en 2001 en Nirgendwo in Afrika (En un lugar de África), ganadora del Oscar a la mejor película de habla no inglesa.