Justina Machado comenzó su carrera sobre los escenarios con actuaciones en el Latino Chicago Theatre. Participó en Blade to the Heat y Black Butterfly en el renombrado Mark Taper Forum de Los Angeles.

Para televisión, Machado ha participado en Urgencias y ha tenido apariciones especiales en Ghost Whisperer, Caso abierto, Anatomía de Grey y Ugly Betty, entre otras. También ha protagonizado el piloto I Love Lupe para CastleRock. Recientemente, ha trabajado en la serie de HBO aclamada por la crítica y ganadora de numerosos premios A dos metros bajo tierra. Inmediatamente después, protagonizó la comedia de NBC Alpha Mom. También protagoniza el thriller de ABC de próximo estreno Fatal Contact junto a Joely Richardson.

Sobre los escenarios, Machado ha protagonizado recientemente la versión musical de Los reyes de mambo en el Golden Gate Theatre en San Francisco, por la que ha recibido impresionantes críticas.

En cine, tuvo un personaje secundario en la rompedora película de Steven Soderbergh Full Frontal y en la de Nick Cassavetes Atrapada entre dos hombres junto a Robin Wright Penn y James Gandolfini. Sus trabajos más recientes en la gran pantalla inlcuyen Destimo final 2 y Torque junto a Ice Cube. Pronto la veremos en la película de Bertrand Tavernier In The Electric Mist junto a Tommy Lee Jones.