Lois Smith nació en Topeka, Kansas; cuando tenía 11 años, su familia se trasladó a Seattle, donde Smith asistió a la escuela, además de estudiar dos años en la University of Washington School of Drama.

Su primer papel como actriz de teatro profesional fue como la hija adolescente de Melvyn Douglas en la obra de Broadway Time Out for Ginger, a la que le siguieron las obras The Young and Beautiful, Blues for Mr. Charlie, y la producción original de Orpheus Descending. En 1988, Smith comenzó a trabajar en el Steppenwolf Theater de Chicago en la producción de The Grapes of Wrath, dirigida por Frank Galati, y en 1993, se incorporó como miembro del Steppenwolf Ensemble. The Grapes of Wrath se trasladó a Londres y Broadway; Buried Child de la Steppenwolf, dirigida por Gary Sinise, también se trasladó a Broadway, y Smith obtuvo nominaciones a los premios Tony® por su trabajo en ambas obras. Además, Smith protagonizó Mother Courage y The Royal Family en la Steppenwolf.

Smith ha interpretado numerosas obras de teatro, tanto en salas de Broadway como off-Broadway, y en teatros regionales. Entre las favoritas se incluyen tres obras de Chéjov: El tío Vanya en el Mark Taper de Los Ángeles, dirigida por Harold Clurman; La gaviota en el Guthrie de Minneapolis, dirigida por Lucian Pintilie; y El jardín de los cerezos en el Baltimore Center Stage, dirigida por Irene Lewis. Entre sus otros créditos teatrales se incluyen: The Front Page, en el Long Wharf y dirigida por Harris Yulin; Escape From Happiness de George Walker, dirigida por Irene Lewis en el Baltimore Center Stage; The Stick Wife de Darrah Cloud en el Hartford Stage, dirigida por Roberta Levitow; y Defying Gravity de Jane Anderson, off-Broadway, dirigida por Michael Wilson. Smith hace años es miembro del The Actors Studio y el Ensemble Studio Theater, donde ha interpretado en numerosas maratones de obras en un solo acto, en especial en las obras de Romulus Linney, y The Man Who Climbed the Pecan Trees de Horton Foote. En 2005–2006, Smith dio vida a Carrie Watts en The Trip to Bountiful de Horton Foote, en el Signature Theatre de la ciudad de Nueva York; su interpretación le valió a Smith cinco galardones: un premio Obie, un premio Lucille Lortel, un Drama Desk, un Outer Critics Circle y un premio Kingsley-Evans. Más recientemente, Smith interpretó la producción de Playwrights Horizons After the Revolution.

Cuando Smith comenzó a trabajar en Nueva York, solían rodarse para la televisión numerosas antologías de obras dramáticas. Smith interpretó numerosas obras para televisión; las primeras fueron en vivo. Entre ellas se incluyen: Miss Julie y The Master Builder en el segmento de la película de la semana de la Televisión Pública. Desde entonces ha aparecido en numerosos telefilmes y miniseries, e intervenido como estrella invitada en series tanto de comedia (“Frasier”, “Just Shoot Me”) como dramáticas (“Law and Order”, “Cold Case”, “ER”, “Grey’s Anatomy”, etc.) En HBO, Smith protagonizó las películas True Blood, Truman, Iron Jawed Angels y The Laramie Project.

Su primer papel cinematográfico fue como la camarera de la película Al este del Edén, protagonizada por James Dean. Smith obtuvo un premio National Society of Film Critics por Five Easy Pieces. Entre sus otros créditos cinematográficos se incluyen: Diminished Capacity, Roadie, Please Give, Hollywoodland, Próxima parada Greenwich Village, Four Friends, La viuda negra, Un día de furia, Tomates verdes fritos, Twister, Larger Than Life, Donde reside el amor, Pena de muerte y Minority Report.”