Samantha Spiro se formó en la academia Webber Douglas Academy of Dramatic Art. Entre sus obras de teatro se incluyen Cuento de Navidad en el teatro Noel Coward Theatre; Di and viv and Rose en el Theatre Royal Bath; Macbeth y The Taming of the Shew para el Shakespeare's Globe; Filumena en el Almeida Theatre; Company en el Sheffield Crucible; Chicken Soup with Barley, en el Royal Court Theatre, por la que recibió una nominación al premio Natasha Richardson en la categoría de mejor actriz en los premios Evening Standard Theatre Awards en 2011 y una nominación a mejor actriz en la categoría de Play Award en los premios Whatsonstage.com en 2012; Hello Dolly en el teatro al aire libre del Regent's Park, por la que ganó un premio Olivier a mejor actriz en un musical en el año 2010; Much Ado About Nothing, también en el Regent's Park; Twelfth Night, en el Donmar/Wyndhams; Funny Girl en el festival de Chichester; The Family Plays en el Royal Court Theatre; Two Thousand Years en el Royal National Theatre; A Little Night Music en el Chicago Shakespeare Theatre, por la que ganó en 2004 el premio Joseph Jefferson a mejor actriz de reparto en un musical; Sueño de una noche de verano en el Crucible (Sheffield); Bedroom Farce en el Aldwych West End; Merrily We Roll Along, en el Donmar, por la que ganó el premio a mejor actriz en un musical en los Olivier del año 2001 y en los Whatsonstage.com del mismo año; As You Like It en el Crucible/Lyric; Jumpers para el Birmingham Repertory Theatre; Cleo, Camping, Emmanuelle and Dick en el Royal National Theatre; Roots en Watford Palace/Oxford; As You Like It para el West Yorkshire Playhouse/Bristol Old Vic; Teechers y On the Piste para Hull Truck/No 1 Tour; How the Other Half Loves en el Theatre Royal (Windsor); giras con Glyn & I y Sueño de una noche de verano, y Tons of Money para el Mercury Theatre.

Entre sus trabajos en televisión están las series Plebs, de ITV2, y Panto!, de ITV; El show de Tracey Ullman, London Spy y The Wrong Mans, de la BBC; Rock and Chips, After You've Gone, Bad Education, de Tiger Aspect; Psychobitches, Rebecca Front's Little Cracker: Rainy Days and Mondays, Grandma's House, por la que ganó un premio British Comedy en 2010 en la categoría de mejor actriz revelación de comedia; Coupling, de Hartswood Films; M.I.T y The Bill, de Thames; Cold Feet, de Granada, y TVGoHome y Noble & Silver de Channel 4.

Entre sus películas se incluyen A Running Jump, Tomorrow La Scala!, From Hell, Cor, Blimey! y Beyond Bedlam.

También ha hecho trabajos para radio, como Inspector Steine Series 4: The Return of Inspector Steine, de la BBC Radio 4; Show Boat, Inspector Steine Series 3, Development, Just Between Ourselves, The Casebook of Inspector Steine, Hors Buchholz and Other Stories, Waiting for Di, Tony's Little Sister and the Paradox of Monasticism, Otherkin, Sad Girl, Talking to Strangers, The Piper's Chair, Snap, Spring Forward, Fall Back, By the Coast of Coromandel, Don't Step on the Cracks, Little Cinderellas, Beside the Seaside y The Gospel According to Mary Magdalene, de BBC Radio 3.