Tuppence Middleton debutó en el cine con el papel femenino principal, Justine, de la película de culto, Tormented. Posteriormente participó en las aclamadas por la crítica Skeletons y Chatroom. También interpretó a la protagonista del corto nominado a los BAFTA, Connect.

Middleton también participó en el thriller, Amenaza terrorista; Trance, película de Danny Boyle, en la que trabajó junto a James McAvoy; Mejor otro día, de Pascal Chaumeil, estrenada en el Festival de Cine de Berlín; y, más recientemente, en el drama biográfico The Imitation Game (Descifrando Enigma), nominado tanto a los Globos de oro como a los Oscar®. Entre sus próximos proyectos están el papel de Helene Kuragin en la producción teatral de la BBC/Weinstein Company, Guerra y paz, dirigida por Tom Harper y en la que también actúan Paul Dano, Lily James y James Norton.

De sus trabajos en televisión se pueden citar Bones; First Light; Friday Night Dinner; Sinbad; y, más recientemente, Spies of Warsaw, en la que trabajó junto a David Tennant, así como el papel femenino principal, Iris Carr, del telefilme The Lady Vanishes, ambas para la BBC. En la actualidad ha vuelto a trabajar con los hermanos Wachowski en la serie de ciencia ficción de Netflix, Sense8.

El debut teatral de Middleton se produjo en la obra de Graham Green, The Living Room, en el Jermyn Street Theatre.